Apoptosi e necrosi negli organi circumventricolari dopo emorragia subaracnoidea sperimentale rilevata con immunocolorazione con annessina V e caspasi 3
Obiettivi: gli organi circumventricolari (CVO) sono essenziali per la maggior parte delle funzioni autonomiche ed endocrine. Traumi e sanguinamenti possono influenzare la loro funzione. Lo scopo di questo studio era di studiare l'apoptosi e la necrosi nei CVO nel periodo iniziale dopo l'emorragia subaracnoidea sperimentale (SAH) nei ratti, utilizzando l'affinità per l'annessina V e l'immunocolorazione della caspasi 3.
Metodi: Sono stati utilizzati tre gruppi sperimentali: i giorni 1 e 2 dopo l'ESA e un gruppo di controllo, composto da sette ratti albini Wistar ciascuno. L'emorragia subaracnoidea è stata ottenuta mediante puntura transclivale dell'arteria basilare. I ratti sono stati perfusi con NaCl allo 0,9% e tampone fosfato 0,1 M a pH 7,4 fino all'arresto cardiaco. L'apoptosi e la necrosi nei CVO sono state misurate mediante citometria a flusso con colorazione dell'annessina V e mediante immunocolorazione della caspasi 3.
Risultati: Apoptosi nell'organo vasculosum lamina terminalis (OVLT) , l'eminenza mediana (ME), e l'area postrema (AP) erano significativamente più alte nel gruppo del giorno 1 rispetto al gruppo di controllo. L'apoptosi nell'organo subforniziale (SFO), OVLT, ME e AP era significativamente più alta nel gruppo del giorno 2 rispetto al gruppo di controllo. Sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi del Giorno 1 e del Giorno 2, ad eccezione dell'AP. La necrosi in SFO e OVLT era significativamente più alta nel gruppo del giorno 2 rispetto al giorno 1 o ai gruppi di controllo, mentre la necrosi in ME e AP non differiva tra i tre gruppi . La densità cellulare positiva alla caspasi 3 era più intensa nel gruppo del giorno 2 rispetto al gruppo del giorno 1 e ai gruppi di controllo.
Discussione: la prevenzione dell'apoptosi può potenzialmente migliorare le funzioni compromesse dei CVO dopo SAH.
Introduzione
L'apoptosi è la morte cellulare programmata, che viene alterata in condizioni patologiche come l'emorragia subaracnoidea (SAH) .1 Si ritiene che l'apoptosi contribuisca alla patogenesi delle lesioni cerebrali precoci2, del vasospasmo3 e degli infarti cerebrali4 osservati dopo l'ESA. In letteratura sono riportati casi di apoptosi1,2,5,6 e necrosi7,8 dopo ESA e miglioramenti in questi casi dopo la somministrazione di inibitori dell'apoptosi.5,6 Gli studi hanno dimostrato d che l'inibizione delle vie apoptotiche successive alla SAH non solo ha ridotto la morte cellulare
ma ha anche comportato un miglioramento significativo dei risultati funzionali,2,4 e quindi potrebbe aver soppresso molte delle lesioni secondarie associate alla SAH.1
Oltre a molti importanti centri del cervello, esistono numerosi organi sensoriali circumventricolari (CVO), come l'organo subforniziale (SFO) , l'organo vasculosum lamina terminalis (OVLT), l'area postrema (AP) e l'eminenza mediana (ME, un CVO secretorio), sono influenzati da SAH. strong>9,10 Gli organi circumventricolari sono ricchi di neurotrasmettitori e sono privi di barriera emato-encefalica.11,12
È stato dimostrato che l'Annessina V interagisce fortemente e specificamente con fosfatidilserina, e quindi può essere utilizzato per rilevare l'apoptosi precoce.15 L'immunocolorazione della caspasi 3 è un altro metodo attualmente utilizzato per rilevare l'apoptosi nei campioni di tessuto.16
In questo studio, abbiamo studiato la presenza di apoptosi precoce e tardiva apoptosi/necrosi mediante affinità per l'annessina V e immunocolorazione della caspasi 3 nei CVO dopo SAH sperimentale nei ratti. Nella nostra revisione della letteratura, non siamo riusciti a trovare alcun rapporto precedente che trattasse questo argomento.
Materiali e metodi
Il protocollo di studio è stato approvato da Bu Comitato di etica animale dell'Università di Bu¨lent Ecevit.
Gli esperimenti sono stati condotti presso il Laboratorio sperimentale di chirurgia, ricerca e animali dell'Università di Bu¨lent Ecevit, Facoltà di Medicina, Zonguldak, Turchia. In totale, sono stati inclusi nello studio 21 ratti albini Wistar maschi adulti, del peso di 200-300 g. Tutti i ratti sono stati mantenuti a 22–25°C con umidità adeguata, in un ciclo luce/buio di 12/12 ore, e hanno ricevuto liquidi e cibo ad libitum. I ratti sono stati divisi in tre gruppi come segue: Giorno 1 dopo SAH (n 5 7), Giorno 2 dopo SAH (n 5 7) e controlli (n 5 7).
I ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (60 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). L'ESA sperimentale è stata eseguita con una tecnica simile a quella descritta da Barry et al.,17 descritta in precedenza.9,10
In breve, è stata praticata un'incisione cervicale mediana in posizione supina, sotto intervento chirurgico microscopio (Takagi OM-5, Giappone) e il clivus è stato esposto utilizzando l'approccio parafaringeo anteriore. Un finestrino ossuto w davanti all'arteria basilare è stato realizzato utilizzando aghi di grosso calibro, facendo estrema attenzione a non aprire la cisterna prepontina. Un ago da sutura con un diametro esterno di 75 mm (Ethicon, Livingston, UK) è stato inserito nell'arteria basilare. Il ritiro dell'ago ha provocato un'estesa emorragia nello spazio subaracnoideo, con distribuzione uniforme fino all'area olfattiva. I ratti sono stati mantenuti in vita per 1 e 2 giorni dopo la SAH in condizioni appropriate.
I ratti sono stati soppressi mediante perfusione. Sotto anestesia, è stata eseguita la toracotomia, quindi il ventricolo sinistro è stato incannulato, l'aorta discendente clampata, l'atrio destro inciso e il sangue lavato dalla testa e dalle regioni cervicali con NaCl allo 0,9% e tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) finché il cuore non si è fermato. Gli animali sono stati decapitati e campioni di SFO, OVLT, ME e AP sono stati ottenuti utilizzando un atlante stereotassico di ratto (Paxinos & Watson).
Il principio del metodo dell'annessina V consiste nel misurare mediante citometria a flusso l'affinità dell'annessina V con la fosfatidilserina, che viene traslocata dalla membrana plasmatica interna al lembo esterno durante l'
apoptosi.15 Le cellule sono state raccolte dai vari CVOs separatamente. Abbiamo utilizzato 100 ml di sospensione cellulare per ciascun campione. Annessina V coniugata con cellule apoptotiche colorate con fluoresceina isotiocianato (FITC) in presenza di ioduro di propidio (PI). Questa reazione consente il rilevamento della fosfatidilserina sulla superficie delle cellule apoptotiche. Sia le cellule PI-positive che quelle annessina V-positive indicavano lo stato necrotico percentuale. Abbiamo utilizzato un kit commerciale di annessioni FITC (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) in conformità con le istruzioni del produttore e un Coulter FC500 > citometro a flusso (Beckman-Coulter). Una presentazione schematica della perdita di asimmetria lipidica della membrana durante l'apoptosi precoce e del legame specifico dell'annessina V alla fosfatidilserina è mostrata in Fig. 1. Le cellule PI positive e l'annessina V positive indicano apoptosi tardiva o necrosi (Fig. 1).
Per l'analisi istopatologica e immunoistochimica, CVO Per tutti i gruppi sono stati utilizzati cervelli ottenuti dai ratti. I campioni di organi circumventricolari di ciascun ratto sono stati fissati in una soluzione di formalina neutra al 10% e quindi incorporati in cera di paraffina. Le sezioni sono state tagliate su un criostato a 5–6 mm spessore Le sezioni di tessuto sono state quindi deparaffinate e colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e viola cresilico per l'analisi istomorfologica. Gli organi circumventricolari sono stati valutati al microscopio ottico da un singolo patologo(FB)cieco rispetto ai gruppi di studio. Per valutare l'apoptosi è stata eseguita anche l'analisi immunoistochimica utilizzando l'anticorpo policlonale anticaspasi 3 (CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA). L'immunocolorazione si è basata sulla tecnica del complesso streptavidina-biotina-perossidasi con recupero dell'antigene a microonde utilizzando tessuti inclusi in cera di paraffina fissati in formalina. Le sezioni incluse nella cera sono state raccolte su vetrini e poi deparaffinate e reidratate. Dopo la deparaffinazione, le sezioni sono state trattate con perossidasi di idrogeno al 10% in acqua filtrata per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Per il recupero dell'antigene, i vetrini sono stati bolliti con 10 mmol/L di tampone citrato (pH 7) per 10 minuti in un microonde. I vetrini sono stati quindi incubati con antisieri primari, incluso l'anticorpo policlonale di coniglio caspasi 3 (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Dopo il lavaggio in soluzione salina tamponata con fosfato, i tessuti sui vetrini sono stati incubati con un anticorpo secondario coniugato con biotina, seguito da incubazione nei componenti del sistema streptavidina-biotina per 30 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni sono diventate visibili dopo l'immersione dei campioni in 3,39-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA). Successivamente le sezioni sono state controcolorate con ematossilina, quindi risciacquate e montate. Nel controllo negativo è stato omesso l'anticorpo primario e il tessuto tonsillare è stato utilizzato come controllo positivo. L'immunoreattività della caspasi 3 è stata osservata prevalentemente nel citoplasma con qualche colorazione nucleare. I vetrini sono stati valutati in cieco da un singolo patologo (FB). L'apoptosi, misurata dalla densità cellulare positiva alla caspasi 3, è stata valutata nei CVO per ciascun gruppo.
Analisi statistica
Il pacchetto statistico per le scienze sociali Per tutte le analisi dei dati è stato utilizzato (versione 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA). I risultati sono stati espressi come mediana e range. Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per testare la normalità per variabili senza distribuzione normale, mentre il test di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per i confronti tra i tre gruppi. Il test Conover era utilizzato per confronti post hoc. Per tutti i confronti statistici, 0,05 è stato considerato statisticamente.
Risultati
I risultati citometrici a flusso sono riepilogati nella Tabella 1. Grafici ottenuti da PI/annexina V significativa l'analisi della citometria a flusso di SFO, OVLT, ME e AP (gruppi di controllo e Giorno 2) è riportata in Fig. 2. Nel gruppo del giorno 1, i risultati dell'apoptosi precoce, mostrati come mediani (intervallo), erano i seguenti: OVLT 0,50% (0,08–1,89), ME 0,55% (0,21–0,84) e AP 0.46% (0,20–1,86), apoptosi nell'SFO non differivano significativamente da quelli del gruppo di controllo. Per il gruppo del Giorno 2, l'apoptosi precoce è stata la seguente: SFO 1,88% (0,97–2,99), OVLT 1,85% (0,77–3,16), ME 0,79% (0,54–1,43) e AP 0,82% (0,19–1,49 ). ), che era significativamente più alto in tutte e quattro le aree rispetto al gruppo di controllo. Nel gruppo di controllo, l'apoptosi precoce è stata 0,12% (0,02–0,35) nell'SFO, 0,15% (0,04–0,71)nell'OVLT, 0,18% (0,09–0,34) > nelME, e 0,06% (0,01–0,24) nell'AP.
Necrosi nell'SFO e OVLT nel gruppo del Giorno 2 è stato significativamente più alto rispetto sia al gruppo del Giorno 1 che a quello di controllo, e i risultati per ME e AP non differivano tra il gruppo del Giorno 1 e quello di controllo
L'esame istopatologico delle sezioni SFO, OVLT, ME, e AP ha mostrato una perdita cellulare più evidente nel gruppo del Giorno 2 rispetto al gruppo del Giorno 2 gli altri gruppi.
La densità cellulare positiva alla caspasi 3 era più intensa nel gruppo del giorno 2 rispetto agli altri due gruppi. C'erano poche cellule positive alla caspasi 3 nel gruppo di controllo e il gruppo del giorno 1 aveva meno cellule positive alla caspasi 3 rispetto al gruppo del giorno 2.
Discussione
L'apoptosi è uno dei meccanismi nell'evoluzione della morte cellulare, che può essere osservata dopo SAH clinica e sperimentale.
In questo studio suiCVO dopo SAH sperimentale, nei ratti, l'apoptosi è stata osservata in SFO, OVLT, AP, e ME. Nel gruppo di studio del giorno 1, abbiamo riscontrato una maggiore affinità dell'annessina V con la fosfatidilserina (apoptosi precoce) in tutti i CVO tranne l'SFO. Nel Giorno 2 g
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